细胞冻存、复苏的原理和注意事项

1 细胞冻存的原理和注意事项

1.1 细胞冻存原理

细胞冻存是指将细胞保存在超低温环境中，暂时停止细胞的代谢活动，使细胞进入“冬眠”的一项技术，待需要时再将其复苏。

一般细胞冻存遵循“慢冻”原则，常使用二甲基亚砜（DMSO）或甘油作为细胞冷冻保护剂，一方面可以提高细胞膜对水的通透性，使细胞内水分渗出到细胞外，在一定程度上可以减少胞内冰晶的产生，另一方面可以使冰点降低，延缓整个冷冻过程。

1.2 细胞冻存注意事项

1.2.1 细胞的冻存时如若没有程序性降温盒，可采取手动梯度降温：4℃ 下存放 20min，转入 -20℃ 冷冻 30min，再转入 -80℃ 过夜，最后转移到液氮（-196℃）中长期保存。但不太建议使用手动梯度降温，尤其是一些珍贵的细胞，因为手动梯度降温不好把控，温度不稳定，容易降低存活率。

1.2.2 当使用含异丙醇的程序降温盒时，盒内异丙醇的量必须高于最低刻度线，冻存使用5次后需更换异丙醇，以免影响冻存效果；使用泡沫程序降温盒时，需等盒子恢复到室温再用，不能从冰箱里拿出来直接使用。

1.2.3 细胞短暂冻存时可以配备一台-86℃超低温冰箱，一般超低温冰箱保存细胞可达数月，对于不需要长期冻存的细胞，可暂时保存在超低温冰箱中。

1.2.4 0℃～-60℃ 是“危险温区”，低温损伤主要发生在这一温度区内，不宜将冻存细胞保存在这一温度范围内过久。当从 4℃ 转移至 -20℃ 时，建议上下颠倒混匀细胞，可以防止细胞大量沉降堆积在管底，影响细胞复苏。

1.2.5 细胞冻存最好取对数生长期的细胞，细胞汇合度达 80% 以上 ，可以大大提高细胞复苏存活率，对于娇贵的细胞可以通过适当提高冻存液中血清的比例来保证获得更高的存活率和细胞活力。

1.2.6 细胞冻存密度不能太低，因为冻存和复苏时会损失部分细胞，所以冻存时适当提高细胞密度有助于提高细胞复苏存活率。

1.2.7 配制细胞冻存液时，因为DMSO溶解在培养基中会释放大量热量，所以细胞冻存液需提前配制，切忌直接将DMSO加入含有细胞的培养基中，避免烫伤细胞。

2 细胞复苏的原理和注意事项

2.1 细胞复苏原理

细胞复苏是指将细胞从液氮或 -80℃ 冰箱中取出快速融化，使细胞重新恢复活力的一项技术。

一般细胞复苏遵循“快融”原则，短时间内融化胞外结晶，避免缓慢融化致使水分渗入胞内形成胞内再结晶损伤细胞，融化越快，细胞损伤越小。

2.2 细胞复苏注意事项

2.2.1 为防止冻存管在水浴锅中升温时突然爆炸，可以在放入水浴锅前先在生物安全柜中把盖子拧松一下然后再拧上。

2.2.2 从液氮罐里拿出细胞不是一定要争分夺秒地放入水浴锅中，因为细胞从液氮的-196℃ 上升到 -80℃ 这个过程对细胞是没有损害的，我们有足够的时间处理。但是，如果一旦细胞化了，就应该分秒必争的把它转移至预先准备的培养基中，其目的是为了稀释细胞冻存液中的DMSO，因为在常温下高浓度DMSO对细胞的损害比较大。

2.2.3 我们解冻细胞时可以不用等细胞全融化了才从水浴锅中取出，当观察到冰块浮起来就差不多了，注意水浴时间最好不超过 1min。此外，放入生物安全柜前喷酒精消毒也会耗费一些时间，整个解冻过程尽量保证在 3min 内完成。

2.2.4 将解冻的细胞转移至培养基中时，先把已经融解的部分转移至含有新鲜培养基的离心管中，再从离心管中吸取少量培养基至冻存管中，余下的冰块瞬间融化，再全部转移至离心管中离心弃上清（该做法是为了去除DMSO），加入新鲜培养基重悬后接种至培养瓶中培养。

2.2.5 细胞复苏后，贴壁细胞复苏 24h 后镜下观察，若密度达到 80%，则正常传代；若密度不到 80% ，则继续培养到 48h 再换液。悬浮细胞复苏 72h 内不建议离心换液。